神經科學(Neuroscience)專題

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二十一世紀被稱為「神經科學的年代」,隨著美國BRAIN Initiative以及歐盟Human Brain Project的開展,將神經科學的研究推到前所未有的高峰,許多嶄新的技術與研究課題如雨後春筍般迅速竄出,在本期Investigator的〈神經科學專題〉中,將聚焦在「全腦圖譜」與「光遺傳學」兩大主題相關研究的重要里程碑與發展現況,內容精彩豐富,有興趣的讀者千萬不可錯過了!

圖片:Brainbow of mice hippocampus by Tamily Weissman, Harvard University. From Cell Picture Show. http://www.cell.com/Cell_Picture_Show-brainbow


“New directions in science are launched by new tools much more often than by new concepts.”–Imaged Worlds, Freeman Dyson

19世紀末期,RamonyCajal利用高基氏體染色(Golgi stain)素描出精細的單一神經元構造1。時至今日,2013年,美國總統歐巴馬宣布Brain Activity Map Project(BRAIN Initiative)正式啟動,將要全方面的建構腦活動圖譜 2。大腦的組成及功能慢慢變成科學上最複雜、最浩大的問題,而神經科學領域也變成當今最炙手可熱的領域之一。本次會跟大家介紹近幾年在腦神經研究領域上,有著重大突破的技術里程碑。

  • 全腦圖譜的挑戰

要了解腦的功能得從大腦的結構開始,構成腦的最單一功能體為:神經元。目前認為人腦約有兩千億個神經元組成,相關聯的神經元相互連接,而一個腦約有一百多兆個連接點。據史丹佛大學(Standford University)的Stepen Smith估算,一個成年人大腦內的連接點比起將地球上所有的電腦與網路加起來的量還要多 3。因此為了破解大腦的連結組成,目前科學家把目標放在比較簡單的模式生物上,例如:線蟲、果蠅或是老鼠。線蟲由於構造簡單、體積小、透明等優點,在1986年Syndney Brenner團隊已經將線蟲體內302個神經圖譜定義完畢4。接下來果蠅與老鼠便成為現今主要了解全腦圖譜的模式生物。

大腦圖譜的觀察與建立目前都需要透過光學影像系統,然而組織的透明度一直是光學儀器很大的限制之一,隨著各種組織澄清溶液的發明(如:ScaleA25與seeDB6),共軛焦顯微鏡所使用的雷射光可穿透到10倍深的腦內部(深度極限從原先的150 μm增加到2 mm 5 Fig.3b),再與3D影像技術整合,可以完整的呈現腦內神經的分布走向。藉由發明水溶性組織澄清液Focus ClearTM的優勢,台灣清華大學的江安世教授(Ann-shyn Chiang)在2011年提出第一個果蠅腦神經圖譜資料庫:FlyCircuit7,8,包涵了兩萬多筆的單一神經元資料(約佔果蠅腦神經20%),預計在3年之後可以完成全果蠅腦10萬腦細胞的圖譜,其中這些資料並包含了神經元的神經傳導物質(如Acetylcholine、Dopamine、GABA及Glutamate等等),是解開大腦組成的重要里程碑。而國際上也一直有學者以解開大腦組為目標開發各種基因工具,如Brainbow就是很好的例子9。2007年,哈佛大學(Harvard University)的Jeff W. Lichtman與Joshua R. Sanes的團隊成功的在鼠腦裡面應用了Brainbow,當由紅色、綠色、黃色、青色螢光蛋白組成的Brainbow載體表現在神經細胞內時,這四種顏色的螢光蛋白會隨機組合配對,就如同構成電視機三原色的映像管一樣,可以使不同的神經細胞,表現出不同的顏色組合,可以想見利用Brainbow科學家可以一次呈現幾百顆細胞的走向,比起傳統一次觀察一顆神經細胞要快上百倍。之後以此原理為基礎的其他團隊也設計出更多更好的神經圖譜工具,現在除了老鼠,Brainbow也成功的應用在果蠅10與斑馬魚11,12上。

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圖一Brainbow image. From Ref 9

回到全腦圖譜的進展,2013年史丹佛大學的Karl Diesseroth將現有的多項技術整合並且發明了CLARITY13,利用hydrogel固定鼠腦內細胞中蛋白與細胞間結構,並進一步移除了會阻礙光穿透率的脂質,使鼠腦透明度增加,因為透明度的大幅度改善,可以使用非侵入性的方法觀察到更深層的組織,將可得到最完整最原始的腦神經連接資訊。此外,CLARITY因為可以重複進行免疫染色標定(可以使用抗體標定鼠腦中的蛋白,洗去原本的抗體之後再標定另一種蛋白,以此類推),理論上我們可以在一個鼠腦中重複的標定不同的蛋白質或是神經傳導物質等等,藉此將是更全面的觀察各種蛋白質在神經中的分布,對於腦功能的瞭解會更加全面性。

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圖二CLARITY image. From Ref 13

  • 『遙控』大腦

另一個神經科學家最著迷領域則是大腦「輸出」的功能。從單一神經元到單一神經元;從單一神經元到腦區;從腦區到腦區,複雜的神經傳導物質與複雜的神經網路是如何經過計算並產生最後的各種生物行為,甚至是形成更為複雜的功能,如:意識、情緒、記憶⋯⋯等等,可以說是神經科學領域最後的「聖杯」。現在科學家結合了外部功能的行為實驗與內部神經連結的大腦圖譜,從內與外這兩方面同時破解大腦是如何運作,所以各種模式動物的行為學實驗近幾年前仆後繼的發明,行為分析也是此領域的另一把「寶劍」。

因此,從模式動物延伸出的行為分析實驗是我們了解大腦運作的第一步。果蠅,除了具有比線蟲還要複雜但比老鼠簡單的神經系統的優點之外,養殖門檻低,生長週期短,體積小,基因工具完備,生物行為精巧而多樣,具有人類75%遺傳疾病的基因等等,以上優點都是近十年來果蠅的行為實驗大量被使用及發展快速的原因。從1960年代由Seymour Benzer等人開始使研究果蠅的行為14,時至今日,果蠅上能使用的行為實驗已經包羅萬象(嗅覺、嗅覺記憶、視覺、視覺記憶、空間記憶、聽覺、痛覺、感應溫度、交配、交配記憶、睡眠、打鬥、覓食、日夜週期、磁場感應、酗酒⋯⋯等等)。2009年,隸屬於霍華德•休斯醫學研究所(Howard Hughes Medical Institute;HHMI)下的研究單位:Janelia Farm Research Campus開始了Fly Olympiad計畫15,是要使用大規模、系統化、標準化的實驗流程來觀察果蠅行為。Fly Olympiad結合操縱(開啓或關閉)果蠅腦內神經活性的基因工具來測試少數神經是否會對某些特定的行為產生影響,目的是要全盤性的瞭解神經網路與動物行為的關係。因為目前大部份的實驗室只能針對單一或是少數行為進行研究,對於神經網路與行為的瞭解非常有局限性,如Janelia farm這樣使用完整的基因工具搭配全面的行為分析,結果可以預見的是會對神經科學領域帶來飛躍性的進展。

4圖三 From Ref 15

當我們瞭解神經如何交錯連結形成大腦,並且能夠科學性的紀錄及分析動物行為時,能精準的開啓或關閉某些特定的神經元的活性的光遺傳學(Optogenetics)就應運而生,它就像是一把遙控器讓你能在遠端「遙控」腦內的神經。在2005年Gero Miesenböck團隊,將能在照射UV光後活化神經的膜蛋白:P2X2表現在果蠅的逃跑中樞神經(giant fiber)上,發現在照射UV之後,因為P2X2活化giant fiber,直接可以觀察到果蠅產生逃跑的跳躍行為,這是第一個藉由操控神經活性改變動物行為的例子16。接著在同年八月,前文提到的Karl Diesseroth將綠藻中的光受器蛋白:Channelrhodopsin(ChR)表現在老鼠海馬迴(hippocampus)的細胞株中,成功的利用藍光激活此神經細胞的活性,證明ChR可以在微秒內激活神經,這是第一個optogeneics利用於哺乳類細胞的例子。因為ChR的靈敏度高及方便,接下來大量的被應用在神經科學領域。2010年跨領域的Nature Method期刊把Optogenetics選為「METHOD OF THE YEAR」17,當初開發optogenetics的先鋒Gero Miesenböck與Karl Diesseroth近幾年更是獲獎無數。接著於2012年Karl Diessorth與諾貝爾獎得主利根川進(Tonegawa Susumu)合作18,在老鼠腦中海馬迴內的齒狀迴(dentate gyrus;DG)注射裝載有ChR的載體並連接光纖至此腦區。在老鼠接受了訓練之後,DG內特定的神經細胞會被活化並表現ChR,而一般認為記憶就是儲存在這些特定的神經細胞裡面,所以利根川進團隊就使用藍光激活這些有儲存記憶的神經細胞,結果非常令人驚訝,老鼠在接受了藍光之後表現出有「記得」的行為,此結果證明了記憶是以特定少數的神經元儲存在腦內(sparse coding),並且可以被人為的激活提取出來,利根川進的結果將optogenetics更進一步從激活神經到激活記憶,轉而探討更為複雜的腦功能:記憶。而除了激活神經的ChR,能靜止神經活性的Halorhodopsin (NpHR)19也同樣被應用在各種行為實驗上,有了ChR與NpHR科學家就能在特定的時間點(光開啓)及特定的空間上(腦區)精準的開啓或關上腦中神經的活性。

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圖四Optogenetics From (http://algaeforbiofuels.com/wp-content/uploads/2011/08/optogenetics-mouse.png),
(http://www.nature.com/nmeth/journal/v8/n1/full/nmeth.f.323.html)

  • 結語

藉由全腦神經圖譜全面瞭解大腦的功能對於人類的影響可能非常深遠,之後的應用性也可能是無遠弗屆影響人類的未來。舉例來說,治療各種大腦病變的疾病患者,研發新的診斷工具,找尋精神疾病的生物性指標(biomarkers),甚至是應用於教育等更為大眾的層面20

目前神經科學領域的前進非常仰賴各種新的實驗工具的發明,而這些實驗工具都必須由資訊、機械、電機、生物資訊、神經生物、神經行為、分子生物學⋯⋯等各個領域的團隊與專家整合,才能創造出探索未知領域的全新實驗工具。不論是從果蠅,或是老鼠,甚至是人類腦功能的瞭解,在未來都極需要各種專業領域的人才投入,腦科學領域的未來已經是全球整合的「整體戰」了。

  • 延伸閱讀:

Optogenetics: controlling cell function with light:
http://www.nature.com/nmeth/journal/v8/n1/full/nmeth.f.323.html

撰文│吳介凱
編輯│張 捷

6作者介紹:
吳介凱
清華大學生物技術研究所博士班六年級,目前研究果蠅的長期記憶與蕈狀體下游神經的關係。專長:行為實驗,組織影像技術。Publication:Chen CC, Wu JK, Lin HW, Pai TP, Fu TF, Wu CL, Tully T, Chiang AS.Visualizing long-term memory formation in two neurons of the Drosophila brain.Science. 2012 Feb 10;335(6069):678-85. doi: 10.1126/science.1212735.


  • 參考文獻:
  1. RyCajal, (1890 (first edition), 1905 (fourth edition)). Manual de AnatomiaPatológica General (Handbook of general Anatomical Pathology)
  2. http://www.whitehouse.gov/the-press-office/2013/04/02/remarks-president-brain-initiative-and-american-innovation
  3. http://med.stanford.edu/ism/2010/november/neuron-imaging.html
  4. White JG, Southgate E, Thomson JN, Brenner S.The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditiselegans.Philos Trans R SocLond B Biol Sci. 1986 Nov 12;314(1165):1-340.
  5. Hama H, Kurokawa H, Kawano H, Ando R, Shimogori T, Noda H, Fukami K, Sakaue-Sawano A, Miyawaki A.Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.Nat Neurosci. 2011 Aug 30;14(11):1481-8. doi: 10.1038/nn.2928
  6. Ke MT, Fujimoto S, Imai T.SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.Nat Neurosci. 2013 Aug;16(8):1154-61. doi: 10.1038/nn.3447. Epub 2013 Jun 23.
  7. Chiang AS, Lin CY, Chuang CC, Chang HM, Hsieh CH, Yeh CW, Shih CT, Wu JJ, Wang GT, Chen YC, Wu CC, Chen GY, Ching YT, Lee PC, Lin CY, Lin HH, Wu CC, Hsu HW, Huang YA, Chen JY, Chiang HJ, Lu CF, Ni RF, Yeh CY, Hwang JK.Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Curr Biol. 2011 Jan 11;21(1):1-11. doi: 10.1016/j.cub.2010.11.056. Epub 2010 Dec 2.
  8. http://www.flycircuit.tw/
  9. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Lu J, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW.Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62.
  10. Hadjieconomou D, Rotkopf S, Alexandre C, Bell DM, Dickson BJ, Salecker I.Flybow: genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster.Nat Methods. 2011 Mar;8(3):260-6. doi: 10.1038/nmeth.1567. Epub 2011 Feb 6.
  11. Pan YA, Livet J, Sanes JR, Lichtman JW, Schier AF.Multicolor Brainbow imaging in zebrafish.Cold Spring HarbProtoc. 2011 Jan 1;2011(1):pdb.prot5546. doi: 10.1101/pdb.prot5546.
  12. Pan YA, Freundlich T, Weissman TA, Schoppik D, Wang XC, Zimmerman S, Ciruna B, Sanes JR, Lichtman JW, Schier AF.Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.Development. 2013 Jul;140(13):2835-46. doi: 10.1242/dev.094631.
  13. Chung K, Wallace J, Kim SY, Kalyanasundaram S, Andalman AS, Davidson TJ, Mirzabekov JJ, Zalocusky KA, Mattis J, Denisin AK, Pak S, Bernstein H, Ramakrishnan C, Grosenick L, Gradinaru V, Deisseroth K.Structural and molecular interrogation of intact biological systems.Nature. 2013 May 16;497(7449):332-7. doi: 10.1038/nature12107. Epub 2013 Apr 10.
  14. Greenspan RJ.Seymour Benzer (1921-2007).Curr Biol. 2008 Feb 12;18(3):R106-10.
  15. http://www.janelia.org/team-project/fly-olympiad
  16. Lima SQ, Miesenböck G.Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.Cell. 2005 Apr 8;121(1):141-52.
  17. Editorial. Method of the year 2010. Nature Methods 8, 1 (2011) doi:10.1038/nmeth.f.321
  18. Liu X, Ramirez S, Pang PT, Puryear CB, Govindarajan A, Deisseroth K, Tonegawa S.Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.Nature. 2012 Mar 22;484(7394):381-5. doi: 10.1038/nature11028.
  19. Zhao S, Cunha C, Zhang F, Liu Q, Gloss B, Deisseroth K, Augustine GJ, Feng G.Improved expression of halorhodopsin for light-induced silencing of neuronal activity.Brain Cell Biol. 2008 Aug;36(1-4):141-54. doi: 10.1007/s11068-008-9034-7. Epub 2008 Oct 17.
  20. Alivisatos AP, Chun M, Church GM, Deisseroth K, Donoghue JP, Greenspan RJ, McEuen PL, Roukes ML, Sejnowski TJ, Weiss PS, Yuste R.Neuroscience. The brain activity map.Science. 2013 Mar 15;339(6125):1284-5. doi: 10.1126/science.1236939. Epub 2013 Mar 7.

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